pCMV-EGFP-p65是碧云天自行研发生产的在哺乳动物细胞中表达EGFP标签的p65融合蛋白的质粒。该质粒含有CMV启动子，带有卡那霉素(Kanamycin)抗性，可以使用

G418 (ST081)

筛选稳定表达融合蛋白的细胞株，是研究NF-κB信号通路的激活和抑制的有效工具。本产品主要适合用于通过荧光显微镜等活细胞观察NF-κB的核转运激活。

NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)，中文名为激活的B细胞核因子kappa-轻链增强子，是细胞内重要的核转录因子，参与细胞对外界刺激的响应、炎症反应、免疫应答等过程，几乎存在于所有类型的动物细胞中。NF-κΒ作为转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：p50 (NF-κB1)、p52 (NF-κB2)、p65 (REL-associated protein, Rel-A)、Rel-B和c-Rel，它们的N端都具有高度保守的RHD (REL homology domain)；5个亚单位根据C端结构域的不同被分为两类，第一类为p50、p52，其C端具有ankyrin重复结构域具有转录抑制活性(Transrepression activity)和招募IKK (Inhibitory κB kinase)的致死结构域(Dead domain)；第二类为p65、Rel-B和c-Rel，其C端具有转录所必需的转录激活结构域(Transactivation domain, TAD)[1]。

NF-κB在静息状态或失活状态(Resting state or inactive state)下，其高度保守的RHD中的核定位信号(Nuclear localization sequence, NLS)与抑制因子IκB (Inhibitor of NF-κB)结合形成非活性复合物，NF-κB以失活状态存在于细胞质中。虽然IκB蛋白掩盖了p65的NLS信号，但没有掩盖p50的NLS信号，因此静息状态下NF-κB可以持续在细胞核和细胞质之间穿梭(Shuttle)维持很低水平的活性[2]。

NF-κB的激活存在两条途径，即经典途径和非经典途径。经典途径：在受到促炎信号(如炎症细胞因子TNF-α、IL-1、病原体和病毒双链RNA等)的刺激后，使细胞中的IKK复合物被招募并激活，IKK复合物由IKKα和/或IKKβ催化亚基以及NEMO (NF-κB Essential Modulator，亦称IKKγ)组成，IKK复合物使IκB被磷酸化，磷酸化的IκB随后发生泛素化被蛋白酶体降解，使得NF-κB的核定位信号暴露从而进入细胞核激活靶基因；非经典途径：该途径由NF-κB抑制激酶NIK (NF-κB inhibitory kinase)介导，NIK磷酸化并激活IKK的亚基IKKα，磷酸化的IKKα再使p100磷酸化，导致加工和释放有活性的p52和RelB异源二聚体转移至细胞核并激活靶标基因，这一过程发生在淋巴器官发育期间，淋巴器官负责产生B淋巴细胞和T淋巴细胞[2]。

pCMV-EGFP-p65转染细胞后通过荧光显微镜观察，静息状态下EGFP-p65均匀的分布在细胞质中，NF-κB被激活后EGFP-p65转移到细胞核内。本产品转染HEK293T细胞的效果如图1所示。

图1.碧云天pCMV-EGFP-p65质粒转染HEK293T细胞效果图。pCMV-EGFP-p65质粒转染HEK293T细胞48小时后，经荧光显微镜观察，静息状态(Inactive state)下，EGFP-p65均匀分布在细胞质中。加入

TNF-α (P6231)

刺激HEK293T细胞后，激活状态(Active state)下，EGFP-p65进入细胞核内。实际荧光强度会因实验仪器、检测条件的不同而存在差异，本图仅供参考。

pCMV-EGFP-p65质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	61-568
EGFP	613-1329
human p65	1396-3045
SV40 poly(A) signal	3166-3287
f1 ori	3294-3749
Ampicillin resistance promoter	3776-3880
SV40 promoter	3882-4239
SV40 ori	4090-4225
Neomycin/Kanamycin resistance gene	4274-5068

pCMV-EGFP-p65质粒(6378bp)的图谱如下：

pCMV-EGFP-p65质粒的详细图谱见说明书：

pCMV-EGFP-p65.pdf

pCMV-EGFP-p65中没有的酶切位点包括：

AbsI	Acc113I	AclI	AcvI	AhdI	AhlI	AjiI
AjuI	AscI	AsiSI	Asp700I	AspEI	BaeI	BarI
BbrPI	BbvCI	BcuI	BmcAI	BmeRI	BmgBI	BsePI
BsiWI	BsmBI	Bsp68I	BssHII	BssNAI	Bst1107I	BstZ17I
BtrI	BtuMI	CciNI	DriI	Eam1105I	Eco32I	Eco72I
EcoRV	Esp3I	FseI	I-CeuI	I-PpoI	I-SceI	MauBI
MluI	MreI	MroXI	MssI	Nb.BbvCI	NotI	NruI
Nt.BbvCI	PacI	PalAI	PauI	PdmI	Pfl23II	PI-PspI
PI-SceI	PmaCI	PmeI	PmlI	Psp1406I	PspCI	PspLI
PspXI	PsrI	PteI	RgaI	RigI	RruI	ScaI
SfaAI	SgfI	SgrAI	SgrDI	SgsI	SmiI	SpeI
SrfI	SwaI	TstI	XmnI	ZrmI

pCMV-EGFP-p65中的单酶切位点包括：

AseI	AT`TA,AT	7	XcmI	CCANNNN,N`NNNNTGG	3006
SnaBI	TAC|GTA	340	XbaI	T`CTAG,A	3049
NheI	G`CTAG,C	591	BclI	T`GATC,A	3059
BmtI	G,CTAG`C	595	MfeI	C`AATT,G	3152
AfeI	AGC|GCT	596	HpaI	GTT|AAC	3165
AgeI	A`CCGG,T	600	AflII	A`CRYG,T	3284
BsrGI	T`GTAC,A	1322	DraIII	CAC,NNN`GTG	3518
PaeR7I	C`TCGA,G	1343	SexAI	A`CCWGG,T	3991
XhoI	C`TCGA,G	1343	SfiI	GGCCN,NNN`NGGCC	4177
HindIII	A`AGCT,T	1352	BspDI	AT`CG,AT	4242
Acc65I	G`GTAC,C	1375	ClaI	AT`CG,AT	4242
KpnI	G,GTAC`C	1379	EagI	C`GGCC,G	4308
BamHI	G`GATC,C	1390	KasI	G`GCGC,C	4401
FspAI	RTGC|GCAY	1609	NarI	GG`CG,CC	4402
BstEII	G`GTNAC,C	1620	SfoI	GGC|GCC	4403
PflMI	CCAN,NNN`NTGG	1737	PluTI	G,GCGC`C	4405
KflI	GG`GWC,CC	1890	PflFI	GACN`N,NGTC	4520
SbfI	CC,TGCA`GG	2180	Tth111I	GACN`N,NGTC	4520
PshAI	GACNN|NNGTC	2273	AflIII	A`CRYG,T	6320
PvuI	CG,AT`CG	2274	PciI	A`CATG,T	6320
AarI	CACCTGC(N)4`(N)4,	2670

pCMV-EGFP-p65质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

CMV-F primer (519-539): 5' -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

EGFP-C-5 primer (1266-1287): 5' -CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3'

SV40pA-R primer (3222-3203): 5' -GAAATTTGTGATGCTATTGC-3'

pCMV-EGFP-p65的全序列信息:

D2820 pCMV-EGFP-p65全序列信息.txt

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D2820-1μg	pCMV-EGFP-p65	1μg
D2820-100μg	pCMV-EGFP-p65	100μg
－	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。